Применение стволовых клеток в регенеративной медицине

Одним из наиболее перспективных достижений в современной медицине является применение стволовых клеток и факторов роста, которое сегодня становится новым, активно развивающимся трендом тканевой инженерии и биотехнологий. Основные популярные направления медицинской науки в настоящее время связаны с изучением регенеративных возможностей организма. В эстетической медицине, пластической хирургии чаще всего в унисон этому используются липофилинг, собственные факторы роста, стволовые клетки и их производные.

Еще в прошлом столетии в работах B. Futrell, G. Rigotti, R. Mazzola и других авторов была показана эффективность и потенциальная регенеративная возможность аутолипотрансплантатов, поскольку в их составе были выявлены мультипотентные стромальные клетки жировой ткани. В сообщении американского общества пластических хирургов за 2012-й год было отмечено, что стволовые клетки, в том числе из жировой ткани, обладают способностью выделять факторы роста, стимулируя заживление и регенерацию, а также могут дифференцироваться в различные клетки при введении в поврежденную ткань. Использование обогащенной тромбоцитами плазмы как депо факторов роста улучшает приживление жировых аутотрансплантатов и не только… Доказана также способность богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) вызывать ангиогенез и заживлять хронические язвенно-некротические дефекты.

Богатая тромбоцитами плазма
Богатая тромбоцитами плазма (БоТП, PRP) — это аутологичный продукт, в котором сконцентрировано повышенное, по сравнению с нормой, количество тромбоцитов в относительно малом объеме плазмы крови. Свойства БоТП схожи с фибриновым клеем в качестве выполнения адгезивных и гемостатических свойств, но, в отличие от фибринового клея, она способна стимулировать (моделировать) как регенеративные процессы мягких тканей, так и остео-, и хондрогенез.
На основании исследований 80-90-х годов прошлого века доказано, что тромбоциты играют решающую роль в моделировании начальных стадий регенеративных процессов. Далее было установлено наличие факторов роста и других биологически активных веществ в альфа-гранулах тромбоцитов. Богатая тромбоцитами плазма была впервые представлена хирургическому сообществу Whitman и соавт.
Интерес научного содружества и клиницистов к БоТП рос и нашел свое применение в пластической эстетической хирургии, как препарат, применяющийся с целью улучшения приживления жировых трансплантатов, а также в регенеративной и сосудистой хирургии для лечения хронических язвенно-некротических дефектов нижних конечностей как отдельно, так и при смешивании с жировым трансплантатом.
В литературе описаны многочисленные способы приготовления и получения БоТП, построенные на принципе разделения неоднородного вещества на фракции (фракционировании) с помощью гравитационных сил путем центрифугирования. После приготовления БоТП хранится при комнатной температуре до потребности, но не более 8 часов. Для активации БоТП, как правило, ее смешивают с 10% хлористым кальцием и 10000-ми единиц бычьего тромбина ex temporo.

Факторы роста
БоТП выполняет свои позитивные функции с помощью биологически активных веществ — факторов роста, веществ белковой природы, которые регулируют фундаментальные процессы на клеточном уровне.
На сегодняшний день установлено наличие следующих факторов роста в тромбоцитах: тромбоцитарный фактор роста (PDGF), включая изомеры αα, ββ и αβ; трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), включая изомеры β1 и β2; тромбоцитарный фактор-4 (PF-4); основной фактор роста фибробластов (bFGF); фактор роста соединительной ткани (CTGF); интерлейкин (IL)-1; тромбоцитарный ангиогенный фактор роста (PDAF); сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF); эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста (PDEGF), фактор роста эпителиальных клеток (ECGF), инсулино-подобный фактор роста (IGF), остеокальцин, остеонектин, фибриноген, витронектин, фибронектин и тромбосподин (TSP).
Факторы роста находятся в неактивном состоянии в α-гранулах тромбоцитов. Когда тромбоциты активируются, факторы роста высвобождаются из них путем дегрануляции. Многие из факторов роста, например, такие как PDGF и TGF-β, переходят в активное состояние после дегрануляции тромбоцитов путем присоединения к ним гистоновых или углеводных цепей.
Активные факторы роста присоединяются к трансмембранным рецепторам таргетных клеток (например, мезенхимальных стволовых клеток, остеобластов, фибробластов, эпидермальных клеток и других), активируют внутриклеточные месседжеры, вызывающие экспрессию генов, которая приводит, в конце концов, к пролиферации клеток, образованию межклеточного матрикса, костной ткани, синтезу коллагена, росту новых сосудов и т.д.
Активная секреция факторов роста начинается в течение нескольких минут после запуска коагуляционного каскада, а более 95% факторов роста выделяются в течение первого часа. Далее тромбоциты синтезируют и выделяют остаточные факторы роста в течение приблизительно семи дней при условии поддержки их жизнеспособности.
Разные факторы роста действуют на разные процессы репарации. Так, например, PDGF вызывает хемотаксис макрофагов, а вместе PDGF, TGF-β и IGF способствуют хемотаксису и митогенезу стволовых клеток и остеобластов, ангиогенезу, формированию костного матрикса и синтезу коллагена. TGF-β и PDGF также принимают участие в минерализации кости. VEGF вызывает ангиогенез и может способствовать заживлению хронических язвенных дефектов. Однако установлено, что при высокой концентрации TGF-β, VEGF может ингибировать формирование кости.
Некоторые авторы считают, что позитивное влияние БоТП реализуется только при количестве тромбоцитов равном 1.000.000/мкл (1000 х 109 / л) и более. Однако данное исследование включало подсчет концентрации лишь одного из многих факторов роста (PDGF), содержащихся в тромбоцитах. Кроме того, повышенная концентрация некоторых факторов роста может способствовать торможению процессов синтеза межклеточного матрикса и ангиогенеза за счет механизма обратной связи, которая приведет к замедлению регенеративно-репатативных процессов.
Следует акцентировать внимание на использовании адекватной техники получения факторов роста. Многочисленные методики в косметологии не всегда обладают реальным действием, потому что бывают часто выдержаны в рамках доказанных показателей.
С точки зрения косметологии необходимо рассматривать возрастные изменения кожных покровов как нарушение нормального состава тканей, их структуры, баланса волокнистых и клеточных элементов. Известно, что с возрастом мы теряем некоторый объем костной ткани, ослабевает связочный аппарат мимической мускулатуры, растягиваются связки и другие составляющие соединительной ткани, которые в молодом возрасте удерживали все на месте. Так, различные экспериментальные работы по изучению возможностей регенерации опорных тканей человека могут иметь хорошую перспективу.

Липофилинг
Сегодня уже широко практикуется восстановление костных возвышений лица, например, бровной дуги, введением аутолипотрансплантата с факторами роста, стимулирующими остеогенез матрикса как основы.
Основные действующие стандарты липофилинга были разработаны еще в 80-х годах прошлого века Sydney Coleman. Из рутинной пластической операции использование собственной жировой ткани превратилось в полноценную технологию аутотрансплантации. Ввиду популярности методики сегодня все более актуальными становятся вопросы стандартизации и оптимизации способа забора и обработки жировой ткани, техники введения, методов визуализации приживления, перечня показаний и противопоказаний к проведению операции, систематизации и оценки результатов лечения и т.д. Интерес представляют изучение реципиентных условий в зоне введения, техника забора трансплантата и подготовка его к введению, оптимизация процедуры и возможность хранения жировой ткани, послеоперационный уход и др. Актуальным становится изучение новых возможностей липотрансплантации, когда преимущества липофилинга потенцируются действием стволовых клеток жировой ткани. В конце XX-го века в ряде исследований было показано улучшение качества кожных покровов с нарушенной трофикой вследствие послеожоговых изменений, возрастных преобразований, расцениваемое как терапевтический эффект липофилинга. За последние годы накоплен опыт проведения липофилинга и липомоделирования. Сегодня все эти тезисы подвергаются детализации, анализу, пересмотру. По данным различных авторов, энграфтмент аутолипотрансплантатов составляет от 40% до 90% от пересаженного объема. Такой широкий диапазон показателей приживаемости жировой ткани свидетельствует об отсутствии стандартов технологии аутолипотрансплантации. На сегодняшний день недостаточно данных, позволяющих отдать предпочтение той или иной технике забора жировой ткани, ее подготовки к пересадке. В различных сообщениях говорится о различных способах введения жировой ткани и ухода за реципиентными зонами, оптимизации донорских участков.
По данным японских исследователей, среди клеток, входящих в состав липоаспирата, собственно адипоцитов оказывается не более 20%, остальной объем представлен клетками соединительной ткани, лейкоцитами, прогениторными клетками, мультипотентными стромальными клетками, биологически активными веществами. До 10% клеточного состава аспирата жировой ткани составляют стромальные, так называемые, стволовые клетки (около 1 млн. в 1 куб. см). Все они вступают во взаимодействие с реципиентными тканями, подвергаются механической травме, ишемии, действию факторов роста, реперфузионным реакциям и др. Наряду с этим происходит гибель зрелых адипоцитов, нарушение ориентации к дифференцировке эндотелиальных и гемопоэтических клеток. Так, при изучении пересаженных клеток была выявлена гибель до 60% адипоцитов. Среди всех клеток жирового аспирата в условиях ишемии и гипоксии наиболее жизнеспособными оказываются мультипотентные клетки жировой ткани. Важным моментом является то, что жизнеспособные клетки перемещенного липотрансплантата (фрагмента жировой ткани) находятся в периферической его части, в промежуточной зоне выявляются признаки воспаления и отека. В центре находится очаг некроза (так называемая зона регенерации), представленный погибшими адипоцитами и выжившими стромальными клетками жировой ткани. Эти данные позволяют говорить о том, что количество выживших после пересадки клеток обратно пропорционально размерам трансплантата. В экспериментальных работах установлено, что оптимальный объем липотрансплантата — до 1,5-2 мм в диаметре.
Важным моментом при планировании липофилинга является выбор донорской зоны. Забор и получение жировой ткани возможны на различных участках тела. В некоторых исследованиях качества жирового аспирата было выявлено, что жировая ткань гипогастрия содержит максимальную, в сравнении с другими частями тела, концентрацию мультипотентных стромальных клеток.
При аспирации жировой ткани следует соблюдать ряд важных технических моментов. Установлено, что использование небольшого отрицательного давления (до 700 мм Hg), а именно такое разрежение достигается при проведении шприцевой липоаспирации, способствует минимальной травматизации жировой ткани. Естественно, это способствует выживаемости адипоцитов.
Кроме этого, щадящая в отношении жировых клеток липоаспирация достигается при использовании канюль диаметром более 3 мм. Мало того, в последних опубликованных данных зафиксировано, что при транспорте из шприца в шприц играет роль перемещение жировой ткани путем давления или отсасывания. То есть, давление поршня шприца приводит к разрушению клеток жировой ткани в области прикосновения. Вакуум-сила, наоборот, не так разрушительна для клеток липоаспирата. Теория «shear stress» (повреждение клеток при
интенсивном перемещении) в отношении липофилинга актуальна в плане оптимизации выживаемости клеточного состава.
Следует отметить, что при повреждении во время центрифугирования на оборотах свыше 3000, длительном контакте с воздухом, контакте с местными анестетиками концентрация адипоцитов резко уменьшается за счет их гибели. Причем, сохраняют в этих условиях жизнеспособность прогениторные клетки. Значит, поврежденный липоаспират имеет более выраженный регенераторный потенциал в меньшем объеме, чем стандартно деликатно полученный. С возрастом концентрация стволовых клеток в липоаспирате уменьшается, то есть возможности регенерации снижаются.
Существует множество методик подготовки липотрансплантата, сутью которых является выделение из липоаспирата необходимого вида ткани. Большинство из них заключаются в отмывании липоаспирата в растворе, его седиментации, центрифугировании. Неоспоримым является тот факт, что эта подготовка является ключевым моментом, гарантирующим эффективность последующего липофилинга. Однако до сих пор не существует единого мнения о том, насколько пагубное влияние на липоаспират оказывают контакт с воздухом и длительный экстракорпоральный период. Исследование Matsumoto et al. касалось оценки последствий экстракорпорального пребывания липоаспирата. Было выявлено, что при его хранении в течение 4-х минут при комнатной температуре значительно повреждались адипоциты. При этом стволовые клетки жировой ткани страдали незначительно. Не следует забывать и о том, что при отмывании жировой ткани для получения свободного от посторонних включений липотрансплантата, мы, кроме прочего, удаляем и биологически активные вещества, которые способствуют энграфтингу. По этому поводу также опубликованы противоречивые данные. Так, по данным некоторых источников, при приготовлении липотрансплантата путем седиментации сохраняется бóльшая концентрация неповрежденных адипоцитов и клеток с ядрами. Важным моментом является то, что при изучении различных растворов, применяемых для отмывания липоаспирата, не выявлено никакой разницы в плане отрицательного влияния на клеточный состав.
При подготовке липотрансплантата путем центрифугирования липоаспират разделяется на фракции за счет разницы в удельном весе различных его составляющих. При этом центрифугирование никак не влияет на факторы, способствующие приживлению ткани. В большинстве исследований показано, что при центрифугировании на скорости более 3000 об./мин. клетки жировой ткани разрушаются. По данным исследований Pulsfort etal., скорость вращения барабана центрифуги не влияет на выживаемость отдельных адипоцитов, но чем выше частота вращения, тем лучше липоаспират очищается от жидкостей и неклеточных элементов.
Успешность введения липотрансплантата и эффективность процедуры зависят от используемых канюль. При этом едва ли не самым важным критерием при их выборе является диаметр инструмента. Существуют данные об улучшении состояния адипоцитов при введении аутолипотрансплантата через канюли диаметром не более 2,5 мм. В то же время, в работе Erdim et al. утверждается, что приживаемость клеток не ассоциируется с диаметром канюли для введения. С технической точки зрения, следует заметить, что введение липотрансплантата канюлями большого диаметра при работе с лицом может привести к погрешностям в создании равномерности контуров. И такой результат не приемлем. Именно поэтому для практикующего специалиста важно обоснованно устранить эти разночтения и установить оптимальный размер трансплантата и диаметр канюли для ввода жировой ткани. Данные о корреляции объема липотрансплантата и его приживаемости очень различаются у авторов. Одни исследователи делятся опытом о более чем 90% приживления при введении 20-50 мл липотрансплантата. Есть работы, в которых говорится об успешном приживлении более 100 мл жировой ткани. Однако во всех случаях исследователи отмечают, что лучше всего приживаются липотрансплантаты, введенные в ткани диффузно, по принципу инфильтрации, с формированием мини-каналов диаметром около 1 мм.
Современные теории выживания аутолипотрансплантата построены на двух принципах. С одной стороны, пересаженные жировые клетки могут выживать как зрелые адипоциты. В этом варианте для приживаемости необходима оптимальная трофика, ангиогенез и адекватные условия реципиентных тканей. С другой стороны, липотрансплантат выживает за счет дифференциации стволовых клеток жировой ткани в адипоциты. При этом условия оксигенации и ангиогенеза в реципиентных тканях могут быть скомпрометированы за счет, например, дистрофии. Доказано, что выживаемость пересаженной ткани зависит от широкого контакта с окружающими тканями, трофики и концентрации биологически активных веществ. С одной стороны, увеличение объема пересаженного жирового фрагмента эффективнее в плане компенсации дефицита тканей, с другой — необходима минимизация этого объема для улучшения его трофики. Есть работы, в которых показано, что идеальный размер пересаженного фрагмента жировой ткани должен иметь диаметр от 0,5 до 2 мм, поскольку в таком случае трофика обеспечивается как минимум путем диффузии. При бóльших объемах пересаженного аутолипотрансплантата решающую роль играет наличие фибробластов, соединительной ткани, кровеносных сосудов, которые находятся в суспензии жировых клеток. Отдельные сообщения о пересадке и приживлении жировых трансплантатов, представляющих собой единый фрагмент жировой ткани, противоречат данным, которые изложены в вышеуказанных источниках.
Липофилинг сегодня следует рассматривать не только как примитивную технику наполнения объемов. В наших работах есть убедительные сведения о качественном превращении покорных тканей при рубцах, изменениях цвета, структуры кожных покровов кистей после двух сессий микролипофилинга. Мы использовали аутолипоаспират с факторами роста в качестве компресса-повязки при реконструкции сосково-ареолярного комплекса в восстановлении молочной железы при мастектомии и получили значительное повышение результативности приживления тканей.

Возможности использования аспиратов жировой ткани изучены все еще не достаточно четко. Применение активированных собственных факторов роста, мультипотентных стромальных клеток жировой ткани, тропных к тканевым повреждениям и дистрофии, открывает новые пути лечения ранее считающихся безнадежными форм заболеваний.
Комбинированное использование автолипофилинга с клеточными технологиями расширяет перспективы в лечении широкого спектра патологий, даже тех, что ранее считались инкурабельными формами.